Spot Cutter是2D实验和质谱的连接纽带，它将2D双向电泳实验2D胶上的蛋白点切取下来，为下一步酶解，质谱提供样品。
传统的手工切取方式不但工作繁琐，耗时，最为重要的是带来极其严重的角蛋白等的污染，且无法对实验数据（蛋白点的去向，质谱结果等）进行追踪，整理。Spot Cutter不但提供了对蛋白点的自动，快速的无污染切取，并对实验数据进行全程追踪，保证数据的有效管理。这些功能的实现同样有赖于强大的2维分析软件----PDQuest。PDQuest实现对Spot Cutter的自动化控制，以及数据的流入/流出（与质谱，生物信息学数据库等相连）．
     本讲义重点介绍如何通过PDQuest实现对仪器的控制，Spot Cutter对蛋白点的切取有两种方式：一 “看”点切点的自由切取方式；二 通过建数据库作为Cutting List的高级切取方式．分别进行阐述．

切取前准备：
１．放好干净的９６孔板（酶标板）
２．放好洗涤针头用的Eppendorf 管，装好干净的水，一般清洗一次即可
　　３．打开电脑
４．打开Spot Cutter
一 “看”点切点的自由切取方式
1．打开PDQuest软件，从Identify进入Basic Excision Tool打开切取窗口

2．Step 1:Acquie Image摄取图象:如样品凝胶是可见光样品，如考染，银染，选择Light On(gel), 如是杂交膜，如PVDF膜，选择Light Off(PVDF),如是荧光样品如Sypro Ruby，选择UV On(Fluor)．点击Acquire Image，仪器会自动打开相应的光源对样品进行成像，在窗口右边你可以看到所成的图象．

提示１：如用UV光源，注意把门关好，不然UV紫外是打不开的．ＵV在打开工作的状态下，机箱右侧的黄灯应该是亮的．（紫外机箱是选配件，为荧光染色方法特殊设计）
３．Step 2:Specify Cuts自由选取要切取的点：激活Add Cut，在图象上单击要切取的蛋白点，或用鼠标在大蛋白点上划一个矩形，软件会自动计算对该点切取几次．Remove Cut撤消已选取的点．　Multiple Cuts/Spot命令允许对一个大蛋白点进行多次切取．在选取第１个点时，会跳出Enter Plate Information窗口，可以输入Plate Name９６孔板的名字，可以选择从哪一孔开始放蛋白点　Starting Well
窗口右侧有一列工具栏，可对图象进行放大，移动，转化，方便对点的选取
４．Step 3:Set Cutter Options设定切取参数，一般不需要进行特别修改，用默认设定即可
５．Step 4:Set Washing Options设定清洗位置，如清洗的管放在位置１，选择Station1
６．点Begin/Resume，开始切取。如切取进行过程中想暂停切取，点Pause，重新点击Begin/Resume可继续切取

提示２：如切取的点超过９６个，仪器会在完成第一块板的切取后暂停，提醒你放入第二块板
７．切取完成后，可点Confirm Cuts确认切取情况，仪器会对样品再进行一次成像，你可仔细检查所成的图象，看切取的情况。

二．通过建数据库作为Cutting List的高级切取方式
　　这种切取方式和简单的看点切点方式不同，它和PDQuest的分析功能紧密联系起来，例如我们在之前的实验中已经通过PDQuest的分析找到了100个有差异性的点，　这100个点保存在一个叫on-off的文件里，这100个点是我们感兴趣，需要切取下来做进一步鉴定的（如何分析建数据库请参考PDQuest中文讲义），通过PDQuest可以直接把这100个点（命名为on-off的数据库）作为Cutting List切取序列表，直接进行切取，而无需每个点去选择点击。这种方法的优点是速度快，软件会自动寻找蛋白点的中心，对大点会自动决定切取次数，对重叠点会自动选择切取区域。
１．从Identify下进入Excision Gel Selection…,出现下面两个窗口，窗口１让你选择要切取的数据库，完成选择后窗口２显示切取的一些相关参数。点Proceed进入下一步
　 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２．Integrated Excision Tool切取工具窗口，在此窗口可以看到切取状态，软件会将待切取的点根据浓度从低到高的顺序自动排列．可以在此窗口里设定Cutter Options，这些参数和自由切取方式是一样的．

３．点Align打开下面窗口
回顾一下在PDQuest分析建库之前我们做过什么工作:我们先通过一台成像系统(如FX,VersaDoc,或ChemiDoc等)对2D胶进行了成像工作,而Spot Cutter也会对同一张2D胶进行成像,因此在切取之前需要把这2次成像的图象重叠在一起．Align 就是完成这个功能的．
首先软件提醒你把要切的胶放到Spot Cutter上，点Gel Ready继续． 在此窗口看到的图象是通过成像系统所成的像．           

4．打开Align Analysis and Cutter Images在此窗口中完成两副图的重叠匹配：
Step 1:Image Acquisition图象采集,点击Acquire Image，Spot Cutter会自动打开相应的光源对样品成像，图象出现在右边窗口，左边窗口显示的是成像系统所成的图象

Step2:Date Box Placement数据框确定：在实际的实验中，有可能我们两次放样品的位置不一样（如在成像仪上是正放的，而在Cutter上反放的），这一步可以把图象位置进行调整，如上下旋转等。另外一种情况是，成像仪上所成的图象我们在分析过程中进行了剪切Crop，尺寸要比实际样品的尺寸小，Cutter会自动生成一个数据框（绿色），把相应的区域框出，可移动或调节此数据框的大小

Step 3:Perform Alignment执行匹配,点Auto自动,软件自动将要切取的点在右图中(Cutter所成的图象)找出,标记为红色


   　Step 4: Alignment Confirmation匹配确认, 对自动找出的点进行检查,点Jump and Confirm可在各点间切换,激活的点标记为兰色．仔细检查自动定位的结果，如有错误，可用鼠标直接拖动点进行位置调整


Step5: 检查完毕，点Begin/Resume Cutting，进入切取．
５．切取：输入96孔板信息，点Done进入切取状态

在切取过程中我们可以观察到仪器的切取状态，如哪些点已经切了，正在切哪个点等等。同样也可以在这个窗口设置Cutter Options切取参数。

Pause可暂停切取，Begin/Resume可继续切取；Confirm可确认切取状态，作为图象保存；
Export可将切取数据输出到Excel表格

切取完成。


由此切取方法引申，我们可以设想另外一种情况：有一块凝胶，我们不做比较匹配等分析，而要直接切取它上面的某些点，也可以用这种Cutting List的方法来做。
１．把胶放在成像系统（如FX,VersaDoc,GS-800,ChemiDoc XRS）成像，或直接把Cutter作为成像仪成像（Cutter的分辨率是相当高的），如命名为test
２．对test进行Spot Detection and and Matching,把test自己作为自己的Master母版胶
３．建立Analysis Set，选择Arbitary数据库模型，可以把胶上所有的点都选上，或通过鼠标任意选点
４．Identify下选择此数据库来进行切取，其他操作同上

提示3：如何建数据库详见PDQuest中文讲义

建议最好将建数据库方法附在这里